Abun farawa: RNA
Rubutun juzu'i PCR (RT-qPCR) hanya ce ta gwaji da aka yi amfani da ita a cikin gwaje-gwajen PCR ta amfani da RNA azaman kayan farawa.A cikin wannan hanyar, jimillar RNA ko manzo RNA (mRNA) ana fara rubutawa zuwa DNA na ƙarin (cDNA) ta hanyar juyar da rubutu.Daga baya, an yi qPCR dauki ta amfani da cDNA azaman samfuri.An yi amfani da RT-qPCR a aikace-aikacen ilimin halitta iri-iri, gami da nazarin maganganun kwayoyin halitta, ingantaccen tsangwama na RNA, ingantaccen microarray, gano ƙwayoyin cuta, gwajin ƙwayoyin cuta, da binciken cuta.
Hanyar mataki ɗaya da mataki biyu don RT-qPCR
Ana iya cika RT-qPCR ta hanyar mataki ɗaya ko mataki biyu.Mataki ɗaya RT-qPCR ya haɗu da juzu'i da haɓakawa na PCR, yana ba da damar juyar da rubutun da DNA polymerase don kammala amsawa a cikin bututu ɗaya ƙarƙashin sharuɗɗan buffer iri ɗaya.Mataki ɗaya RT-qPCR kawai yana buƙatar amfani da takamaiman maƙamai na jeri.A cikin matakai biyu na RT-qPCR, ana yin jujjuya rubutu da haɓaka PCR a cikin bututu biyu, ta amfani da ingantattun maɓalli daban-daban, yanayin amsawa, da dabarun ƙira na farko.
| Amfani | Hasara | |
| Mataki Daya | Wannan hanya tana da ƙarancin kuskuren gwaji yayin da ake yin halayen biyu a cikin bututu ɗaya
Ƙananan matakan bututu suna rage haɗarin kamuwa da cuta
Ya dace da haɓakawa / dubawa mai girma, mai sauri da haɓakawa | Ba za a iya inganta halayen matakai biyu ba daban
Tun da an daidaita yanayin halayen halayen ta hanyar haɗa halayen mataki biyu, hankali ba shi da kyau kamar na hanyar mataki biyu.
Adadin abubuwan da aka gano ta hanyar samfurin guda ɗaya ba su da yawa |
| Matakai Biyu | Ikon ƙirƙirar ɗakunan karatu na cDNA masu tsayayye waɗanda za'a iya adana su na dogon lokaci kuma ana amfani da su cikin halayen da yawa
Za'a iya haɓaka kwayoyin halittar da aka yi niyya da kuma abubuwan tunani daga ɗakin karatu na cDNA ɗaya ba tare da buƙatar ɗakunan karatu na cDNA da yawa ba.
Matsalolin amsawa da yanayin amsawa waɗanda ke ba da damar haɓaka haɓakar amsa guda ɗaya
Zaɓin sassauƙan yanayi na faɗakarwa | Yin amfani da bututu da yawa, da ƙarin matakan bututu yana ƙara haɗarin kamuwa da cutar DNA, da cin lokaci.
Yana buƙatar ƙarin haɓakawa fiye da hanyar mataki ɗaya |
Samfura masu alaƙa:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Mataki ɗaya) -SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Mataki ɗaya) -Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Don Rukunin CDNA na Farko
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Zaɓin jimlar RNA da mRNA
Lokacin zana gwajin RT-qPCR, yana da mahimmanci a yanke shawarar ko za a yi amfani da jimillar RNA ko mRNA mai tsafta azaman samfuri don juyar da rubutu.Kodayake mRNA na iya samar da hankali mafi girma, jimillar RNA har yanzu ana yawan amfani da ita.Dalilin wannan shine duka RNA yana da fa'ida mafi mahimmanci azaman kayan farawa fiye da mRNA.Na farko, tsarin yana buƙatar ƙananan matakai na tsarkakewa, wanda ke tabbatar da mafi kyawun farfadowa na samfuri da ingantaccen daidaita sakamako zuwa farawa lambobin salula.Na biyu, yana guje wa matakin haɓakar mRNA, wanda zai iya guje wa yuwuwar samun karkatattun sakamako saboda farfadowa daban-daban na mRNAs daban-daban.Gabaɗaya, tun da a yawancin aikace-aikacen ƙididdige dangin da aka yi niyya ya fi mahimmanci fiye da cikakkiyar ganewar ganowa, jimlar RNA ta fi dacewa a mafi yawan lokuta.
Juya juzu'i na rubutu
A cikin hanyar mataki-biyu, ana iya amfani da hanyoyi daban-daban guda uku don ƙaddamar da amsawar cDNA: oligo(dT) masu ƙira, bazuwar ƙayyadaddun bayanai, ko ƙayyadaddun ƙayyadaddun tsari.Yawanci, oligo(dT) da firamare ana amfani da su a hade.Waɗannan abubuwan share fage suna ɓoye madaidaicin samfurin mRNA kuma suna ba da juzu'i na juzu'i tare da mafari don haɗawa.
| Zaɓin firamare | Tsari da aiki | Amfani | Hasara |
| Oligo(dT) mai share fage (ko anchored oligo(dT) firamare) | Faɗakarwar ƙara zuwa ragowar thymine a wutsiya ta poly(A) na mRNA;anchor oligo(dT) yana ƙunshe da G, C, ko A a ƙarshen 3′ (shafin anga) | Haɗin cDNA mai cikakken tsayi daga poly(A) -tailed mRNA
Ana amfani da shi lokacin da akwai ƙarancin kayan farawa
Rufe wurin yana tabbatar da cewa oligo(dT) na farko yana ɗaure zuwa wutsiya 5' poly(A) na mRNA | Ya dace kawai don haɓaka kwayoyin halitta tare da wutsiyoyi (A).
Sami cDNA da aka yanke daga rukunin farko*2 a cikin poly(A)
Bised don ɗaure zuwa ƙarshen 3′*
*An rage wannan yuwuwar idan an yi amfani da madaidaicin oligo(dT). |
| bazuwar farko
| Tsawon tushe 6 zuwa 9, wanda zai iya ɓata zuwa shafuka da yawa yayin rubutun RNA | Anneal ga duk RNA (tRNA, rRNA, da mRNA)
Ya dace da kwafi tare da mahimman tsari na biyu, ko lokacin da akwai ƙarancin kayan farawa
Babban rabon cDNA | Ana juyar da cDNA daga duk RNA, wanda yawanci ba a so kuma yana iya lalata siginar mRNA da aka yi niyya.
samun truncated cDNA |
| ƙayyadaddun ƙayyadaddun ƙa'idodi | Maɓalli na al'ada masu niyya takamaiman jerin mRNA | takamaiman ɗakin karatu na cDNA
Inganta hankali
Yin amfani da madaidaicin qPCR na baya | Iyakance kawai ga haɗar kwayar halitta guda ɗaya |
Juya fassarar
Reverse transcriptase wani enzyme ne wanda ke amfani da RNA don haɗa DNA.Wasu jujjuya bayanan suna da aikin RNase kuma suna iya lalata madaurin RNA a cikin nau'ikan nau'ikan RNA-DNA bayan rubutawa.Idan ba shi da aikin enzymatic na RNase, ana iya ƙara RNaseH don haɓakar qPCR mafi girma.Enzymes da aka fi amfani da su sun haɗa da Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase da Avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Don RT-qPCR, yana da kyau a zaɓi juzu'i mai jujjuyawa tare da mafi girman yanayin zafi, ta yadda za'a iya yin kirar cDNA a yanayin zafi mafi girma, yana tabbatar da nasarar kwafin RNAs tare da tsarin sakandare mafi girma, yayin da suke ci gaba da gudanar da cikakken ayyukansu a duk lokacin da ake amsawa, yana haifar da mafi girma yawan amfanin cDNA.
Samfura masu alaƙa:
Ayyukan RNase H na juzu'i na fassarar
RNaseH yana iya lalata igiyoyin RNA daga duplexes na RNA-DNA, yana ba da damar ingantaccen haɗin DNA mai ɗaure biyu.Koyaya, lokacin amfani da dogon mRNA azaman samfuri, RNA na iya zama ƙasƙantar da kai da wuri, yana haifar da tsattsage cDNA.Saboda haka, sau da yawa yana da fa'ida don rage ayyukan RNaseH yayin cloning cDNA idan ana son haɗa dogon kwafin.Sabanin haka, jujjuyawar juzu'i tare da ayyukan RNase H galibi suna da fa'ida ga aikace-aikacen qPCR saboda suna haɓaka narkewar RNA-DNA duplexes yayin zagayowar farko na PCR.
Zane na farko
Abubuwan da ake amfani da su na PCR da aka yi amfani da su don matakin qPCR a cikin RT-qPCR yakamata a tsara su da kyau don faɗaɗa mahaɗar exon-exon, inda ƙarar firamare na iya yuwuwa ta faɗi ainihin iyakar exon-intron.Tunda ba a inganta jerin DNA na genomic na ciki ba, wannan ƙirar tana rage haɗarin haɓakar ƙimar ƙarya da aka haɓaka daga gurɓataccen DNA.
Idan ba za a iya ƙirƙira abubuwan farko don raba exons ko iyakoki exon-exon ba, yana iya zama dole a bi da samfuran RNA tare da DNase I ko dsDNase marasa RNase don cire gurɓataccen DNA.
RT-qPCR iko
Ya kamata a haɗa mummunan iko na juzu'i (-RT) a cikin duk gwaje-gwajen RT-qPCR don gano gurɓataccen DNA (kamar samfuran DNA na genomic ko samfuran PCR daga halayen da suka gabata).Wannan iko ya ƙunshi duk abubuwan haɗin kai ban da juyar da rubutun.Tunda rubutun baya baya faruwa tare da wannan iko, idan an lura da haɓakawa na PCR, ana iya kamuwa da cutar DNA.
Lokacin aikawa: Agusta-02-2022
