Kowa yana magana ne game da ƙa'idar gwajin qRT-PCR, ƙirar farko, fassarar sakamako, da sauransu, amma ina tsammanin ya kamata in raba tare da ku aikin gwaji na qRT-PCR.Yana da karami, amma game da sakamako ne.
Kafin yin qRT-PCR, muna buƙatar samun cikakkiyar fahimta game da namu RNA da hanyoyin aiki.Bayan haka, ƙoƙarinmu yana nufin samun sakamako, maimakon yin aiki kawai.Don haka kafin yin qRT-PCR, muna buƙatar ƙayyade batutuwa masu zuwa (wasu daga cikinsu suna aiki ne kawai ga SYBR).
1 Shin kun tabbata RNA ɗinku ba ta ƙasƙanta ba?
NanoDrop 2000 na iya gano taro da tsabtar RNA kawai, amma ba zai iya gano mutuncin RNA ba.
Ƙimar RNA (Lambar Intesity Number) na iya nuna amincin RNA, wanda tsarin Agilent 2100 Bioanalyzer ya gano shi.
Hoto. Tsarin tsari na ƙimar RIN don samfuran RNA daban-daban (eukaryotes)
Koyaya, dakunan gwaje-gwaje gabaɗaya ba su da Agilent 2100 Bioanalyzer.A wannan yanayin, zamu iya ganowa ta hanyar gel na formaldehyde, amma abin da ake buƙata don jimlar adadin RNA yana da girma, don haka hanya mafi sauri shine amfani da gel electrophoresis na yau da kullun.Ana buƙatar kasancewa a cikin yanayin da ba shi da nuclease, don haka wajibi ne a wanke tanki na electrophoresis, kwalban sol, gel bracket da tsefe tare da ruwan DEPC.Agarose kuma ba shi da nuclease (muddin an buɗe shi), kuma Loading Buffer yakamata a sake buɗe shi gwargwadon yiwuwa, tare da gel 1.2%.
Lura cewa gel ɗin dole ne a narkar da shi gaba ɗaya, in ba haka ba zai haifar da ƙungiyoyi marasa daidaituwa, kamar yadda aka nuna a cikin samfurin 9 a cikin adadi.Idan wutar lantarki ya yi yawa ko kuma yana aiki na dogon lokaci zai haifar da zafi kuma ya haifar da lalacewa ta RNA, don haka ya kamata a sarrafa wutar lantarki da lokaci a hankali.Bugu da ƙari, gel Gudun zai iya ƙara ƙayyade ko akwai ragowar DNA a cikin samfurin, kuma ku lura ko akwai adadi mai yawa na rikodi a cikin rijiyar.
Hoto.Gel electrophoresis gano RNA
2 Shin kun tabbata game da tattarawar cDNA ɗin ku?
Kwarewar manyan 'yan'uwa a cikin dakin gwaje-gwaje shine cewa cDNA na tsarin 20 ul da aka samu ta kowane juzu'i yana diluted 20X kai tsaye, yayin da 'yan'uwa mata bayan digiri na biyu suna diluted 10X.Yawancin lokaci na dogara da yanayin.Domin ingancin RNA da kowane mutum ya ambata ya bambanta, matakin jujjuyawar kuma ya bambanta, kuma fasahar jujjuyawar ƙila ba za ta tsaya tsayin daka ba.
Don haka duk lokacin da na sami cDNA mai jujjuyawa, zan fara tsoma shi kusan sau 3, sannan in yi amfani da kwayar halittar gida don yin RT-PCR, yawan zagayowar gabaɗaya shine 25 cycles, don gano takamaiman maida hankali, sannan in tantance ma'anar dilution na ƙarshe.
3 Shin kun tabbata abubuwan farko naku suna da sauƙin amfani?
Yana iya wucewa ta hanyar narkewar qRT-PCR, amma wannan har yanzu yana kashe kuɗi.Don dakunan gwaje-gwajen da ba su da kuɗi mai yawa, lokacin da suka sami ɗimbin gyare-gyare, za su iya amfani da RT-PCR na yau da kullun don ganin ko ƙungiya ɗaya ce kuma gano ƙayyadaddun ƙayyadaddun abubuwan.Idan dakin gwaje-gwaje ba shi da ƙarancin kuɗi, ana iya gano ƙayyadaddun ƙayyadaddun duk abubuwan da ake buƙata sau ɗaya ta hanyar narkewar narkewa.
4 Shin kun tabbata cewa yanayin gwajin ku ya dace?
Yakamata a kiyaye SYBR daga haske mai ƙarfi, don haka gwada kashe hasken sama yayin ƙara reagent SYBR, kuma kawai kuna buƙatar amfani da haske mai duhu don kammala shi.
Ajiye SYBR a 4°C.Lokacin da ake amfani da shi, a hankali a juya sama da ƙasa don haɗawa da kyau don guje wa kumfa, kuma kada ku yi juzu'i da ƙarfi.
Wasu kanne mata suna son zana alamomi a allon PCR saboda tsoron haɗa samfuran, wanda ba daidai ba ne.Saboda alamun ku suna da yuwuwar yin tasiri ga tarin sigina mai kyalli, gabaɗaya ina ba da shawarar yara su yi amfani da littattafan rubutu na gwaji don taimakawa wajen ƙwaƙwalwar ajiya, kamar yadda aka nuna a ƙasa.
Hoto.qRT-PCR samfurin loading zane
5 Ka tabbata kana yin shi daidai?
Ka tabbata ka sa safar hannu, sa safar hannu, sa safar hannu, kuma ka faɗi muhimman abubuwa sau uku.
Domin rage bayyanar SYBR zuwa haske, ni da kaina na so in ƙara samfuri da farko, kamar yadda aka nuna a hoton da ke ƙasa.Bisa ga gwaninta, ƙari na ƙaramin adadin samfuri yana iya haifar da kurakuran samfur.Sabili da haka, don rage girman kuskuren da aka haifar ta hanyar ƙara ƙaramin samfuri, yawanci ina sake ninka samfurin sau biyu, kuma ninka adadin lokacin ƙara samfurin don rage adadin H2O2 da aka ƙara.
Hoto.Tsarin tsari na qRT-PCR lodi
Sannan saita tsarin qRT-PCR kamar haka.
Hoto.zane-zane na tsarin qRT-PCR
NOTE: Tsarin tsari yana buƙatar yin aiki akan kankara.
Bayan ƙara samfurin, manna fim ɗin rufewa na gaskiya.Yi ƙoƙarin kada ku taɓa fuskar fim ɗin rufewa da hannayenku, kawai kuyi aiki daga sararin samaniya a bangarorin biyu na fim ɗin.Domin kuma alamun yatsa na iya yin tasiri ga tarin siginar kyalli.Sa'an nan kuma yi amfani da centrifuge don sauri centrifuge na 10 s a ƙananan gudun don hana samfurin daga rataye a bango.
Samfura masu dangantaka:
Lokacin aikawa: Afrilu-28-2023
