RT-qPCR shine ainihin gwaji na ilimin halitta, kuma dole ne kowa ya saba da shi.Ya ƙunshi matakai guda uku: cirewar RNA, juyar da rubutu zuwa cDNA, da PCR mai kyalli na ainihi.Bai taimaka ba, me ke faruwa?Da alama akwai matsalagwajin juzu'i!Kodayake da alama gwajin juzu'i yana buƙatar ƙara RNA, dNTP, firamare, dajuyar da rubutuzuwa bututun centrifuge da haɗuwa da kyau, amma a cikin ainihin tsarin aiki, har yanzu akwai cikakkun bayanai da ya kamata a kula da su.Bari mu koyi game da shi!

Yadda za a yi hukunci da ingancin RNA?
Don samun cDNA, ingancin RNA yana da mahimmanci!Ana iya gano ingancin RNA musamman daga bangarori biyu:
(1) Mutuncin RNA:Ana iya tabbatar da amincin RNA ta hanyar agarose gel electrophoresis. Ɗaukar eukaryotes a matsayin misali, cikakken jimillar RNA yana da fayyace madauri guda uku, ma'aunin kwayoyin daga babba zuwa ƙanana 28S, 18S, da 5S, kuma 28S ya ninka sau biyu kamar 18S;idan za a iya ganin makada uku, amma nau'in band ɗin ya ɓaci ko Yaduwa yana nufin cewa RNA ta lalace.A wannan lokacin, da fatan za a yi juyar da martani nan da nan kuma ƙara shigarwar samfuri yadda ya kamata;idan ba za a iya ganin bandeji mai ƙananan nauyin kwayoyin halitta ko kuma ba a iya gani ba, RNA ya lalace gaba ɗaya kuma yana buƙatar sake fitar da shi.Agilent 2100 yana nuna amincin RNA tare da mafi girman zane da ƙimar RIN.Idan acid nucleic ya kasance cikakke, tushen tushen electropherogram yana da lebur;idan acid nucleic ya lalace sosai, tushen tushen ba shi da daidaituwa kuma mafi ƙasƙanci ya bayyana;ƙimar RIN tana nuna mutuncin RNA, a cikin kewayon 0-10, mafi girman ƙimar, mafi kyawun ingancin RNA.To, mafi girman matakin cikawa.
(2) Tsaftar RNA:Ana iya gano rabon OD260/280 ta UV spectrophotometry.Idan rabon OD260/280 yana tsakanin 1.9 da 2.1, tsarki yana da kyau sosai.
Sauran kwayoyin halittar DNA na iya haifar da sakamako mara inganci
Lokacin da aka fitar da RNA, RNA da muke samu na iya haɗawa da DNA na genomic (gDNA) wanda ba a tsaftace shi ba.Saboda haka, cDNA bayan juyar da rubutu shima za a gauraya dashigDNA.A lokacin saukar ruwaqPCRdauki,cDNAkuma gDNA na iya haɓakawa a lokaci guda, yana haifar da ƙaramin ƙima na CT, don haka sakamakon zai iya zama bangaranci.
To me ya kamata mu yi a wannan yanayin?Foregeneyana ba da shawara:
(1) Yi tsaftacewar kwayoyin halitta akan RNA mai juyawa, wanda za'a iya cire shi ta hanyar cire shafi yayin hakar RNA;
(2) Yi maganin RNA da aka cire tare da DNAseI , amma dakatar da shi tare da EDTA;
na reagent transcriptiontare da genome share modules;

Yadda za a zabi firamare don juyar da rubutu?
Har ila yau, maƙallan rubutun juye-juye suna shafar sakamakon juyar da rubutun.Kuna iya zaɓar bazuwar firamare, Oligo dT ko takamaiman ƙayyadaddun ƙirar halitta don juyar da rubutu bisa ga takamaiman yanayin gwajin:
(1) Takamaiman rubutun: ana ba da shawarar ƙayyadaddun ƙayyadaddun kwayoyin halitta;
(2) Dogayen juzu'i: Oligo dT/gene-takamaiman abubuwan da aka ba da shawarar;
(3) gutsuttsura na ciki na rubuce-rubuce masu tsayi: ƙayyadaddun ƙayyadaddun ƙayyadaddun ƙayyadaddun kwayoyin halitta/ ɓangarorin bazuwar / bazuwar maɓalli + Oligo dT.Idan an yi gwajin qPCR na gaba, Oligo dT ba za a iya amfani da shi kadai ba, saboda yin amfani da Oligo dT kadai zai iya haifar da 3 'karshen son rai, yana haifar da sakamakon gwajin qPCR mara kyau;
(4) miRNA: Ana iya amfani da madaidaicin madauki ko madaidaicin wutsiya.

Sau nawa ya kamata a narke samfurin cDNA na baya don ƙididdigewa?
Bayan samun cDNA na samfurin juzu'i, sau nawa ya kamata a narke cDNA don gwaje-gwajen qPCR yana da mahimmanci.Idan ƙaddamarwar cDNA ya yi yawa ko ƙasa kaɗan, ana iya shafar ingancin haɓakawa.Za a iya auna maida hankali na cDNA, kuma ta yaya ya kamata a yi?
(1) Ba za a iya auna ma'auni na cDNA na samfurin juzu'i ba, saboda ban da samfurin cDNA, samfurin juzu'i yana ƙunshe da ragowar buffer na juzu'i, reverse transcriptase, primers, da dai sauransu, wanda zai tsoma baki tare da sakamakon ma'aunin maida hankali kuma ya haifar da OD260/280, OD260/230 don haka rabon cDNA baya haifar da abn.A wannan lokaci, wasu abokai za su ce, to, zan auna natsuwa bayan tsarkakewa;Anan, Foregene yana tunatar da cewa cDNA ba a ba da shawarar a tsarkake shi ba, saboda tsawon cDNA da aka samu ta hanyar juyawa ya bambanta, kuma gajeriyar cDNA za ta ɓace a cikin tsarkakewa.
(2) To me za a yi?Kafin gwajin qPCR, za a iya tantance dilution gradient na cDNA ta hanyar gwajin farko.Misali: yi amfani da maganin hannun jari na cDNA, dilution mai ninki 10, da dilution mai ninki 100 azaman samfuri don gwaje-gwajen qPCR, kuma zaɓi ma'aunin dilution tare da ƙimar CT a cikin kewayon 18-28.

Ta yaya ya kamata a juya miRNAs?
miRNA ƙaramin kwayar halitta RNA ce mai madauri guda ɗaya mai girman kusan 22 nt wanda baya ƙididdige adadin furotin.Saboda ɗan gajeren tsayinsa, hanyar qPCR na al'ada yana da wahala a ƙididdige shi kai tsaye, don haka sau da yawa ya zama dole a tsawaita miRNA;Hanyoyin juzu'i da aka saba amfani da su don miRNA sun haɗa da hanyar madauki da hanyar wutsiya.
Hanyar madauki mai tushe ita ce a tsawaita miRNA ta ƙara madaidaicin madauki.Wannan hanyar ganowa tana da mafi girman hankali da ƙayyadaddun ƙayyadaddun bayanai, amma abubuwan ganowa ba su da yawa.Rubutun juzu'i ɗaya kawai zai iya gano miRNA ɗaya kawai da tunani na ciki;Hanyar ƙara wutsiya ta ƙunshi biyu An kammala ta hanyar haɗin gwiwar haɗin gwiwar enzymes guda biyu, waɗanda su ne PolyA polymerase da kuma juyar da rubutun.PolyA polymerase ita ce ke da alhakin ƙara wutsiyar PolyA zuwa miRNA don ƙara tsayinta, kuma juyar da rubutun yana aiwatar da martanin juzu'i.Wannan hanyar tana da babban abin ganowa kuma tana iya gano miRNAs da yawa da nassoshi na ciki a cikin juzu'i guda ɗaya, amma hankali da ƙayyadaddun ƙayyadaddun ƙayyadaddun abu ba su da yawa a cikin hanyar madauki.