A cikin gwaje-gwajen qPCR, ƙirar farko ita ma hanya ce mai mahimmanci.Ko abubuwan farko sun dace ko a'a yana da alaƙa da kusancin ko ingancin haɓakawa ya kai ma'auni, ko ƙayyadaddun samfuran suna da takamaiman, da kuma ko akwai sakamakon gwaji.
Don haka ta yaya za a sanya ƙayyadaddun ƙayyadaddun qPCR mafi kyau?Babban ingancin haɓakawa?
A yau, za mu ɗauke ku don ƙirƙira qPCR masu ƙira tare, kuma bari ƙirar qPCR ta zama ingantaccen ƙwarewa a cikin gwaje-gwaje.
Lokacin zayyana qPCR primers, yawanci kula da abubuwan da ke gaba: ya kamata a tsara abubuwan da aka tsara a cikin introns kamar yadda zai yiwu, tsawon samfurin ya kamata ya zama 100-300 bp, ƙimar Tm ya kamata ya kasance kusa da 60 ° C, kuma matakan sama da ƙasa ya kamata su kasance kusa kamar yadda zai yiwu, kuma ƙarshen firam ya zama G ko C, da dai sauransu.
1. Zane na abubuwan farko da ke kewaye da introns
Lokacin zayyana firam ɗin qPCR, zabar abubuwan da aka tsara a cikin introns na iya hana samfurin gDNA haɓakawa, kuma samfuran duk an samo su daga haɓakar cDNA, don haka kawar da tasirin gurɓataccen gDNA.
2. Tsawon farko
Tsawon farko shine gabaɗaya tsakanin 18-30 nt, kuma ya kamata a sarrafa tsawon samfurin ƙarawa tsakanin 100-300 bp gwargwadon yiwuwa.
Idan na'urar ta kasance gajarta sosai, zai haifar da haɓakawa mara kyau, kuma idan ya yi tsayi da yawa, zai iya yin tsari na biyu (kamar tsarin gashin gashi).Idan samfurin haɓakawa ya yi tsayi da yawa, bai dace da amsawar polymerase ba, wanda zai shafi ingancin haɓakar PCR.
3. GC abun ciki da ƙimar Tm
Ya kamata a sarrafa abun ciki na GC na firamare tsakanin 40% zuwa 60%.Idan ya yi tsayi da yawa ko kuma ya yi ƙasa kaɗan, ba shi da amfani don fara amsawa.Abubuwan GC na gaba da baya ya kamata su kasance kusa da iri ɗaya don samun ƙimar Tm iri ɗaya da zafin jiki.
Ya kamata darajar Tm ta kasance tsakanin 55-65°C gwargwadon yiwuwa, gabaɗaya a kusa da 60°C, kuma ƙimar Tm na sama da ƙasa yakamata ya kasance kusa da yuwuwar, zai fi dacewa kada ya wuce 4°C.
4. A guji zaɓar A a ƙarshen 3′ na farko
Lokacin da ƙarshen 3′ na firam ɗin bai daidaita ba, akwai bambance-bambance masu girma a cikin haɓakar haɓakar tushe daban-daban.Lokacin da tushe na ƙarshe shine A, kuma yana iya fara haɗakar sarkar ko da a yanayin rashin daidaituwa, kuma lokacin da tushe na ƙarshe shine T Lokacin, ingantaccen shigar da rashin daidaituwa yana raguwa sosai.Sabili da haka, yi ƙoƙarin kauce wa zaɓar A a ƙarshen 3′ na farko, kuma yana da kyau a zaɓi T.
Idan farkon bincike ne, ƙarshen binciken 5′ ba zai iya zama G ba, domin ko da an haɗa tushen G guda ɗaya zuwa rukunin masu ba da rahoto na FAM, G kuma yana iya kashe siginar kyalli da ƙungiyar FAM ta fitar, wanda ke haifar da sakamako mara kyau.Bayyana.
5. Rarraba tushe
Rarraba sansanoni huɗu a cikin firamare ya fi dacewa bazuwar, guje wa fiye da 3 a jere G ko C a ƙarshen 3′, kuma fiye da 3 a jere.G ko C suna da sauƙi don samar da haɗin kai a cikin yanki mai arzikin GC.
6. Ya kamata yankin ƙira na farko ya guji hadaddun sifofi na biyu.
Tsarin na biyu da aka kafa ta madauri ɗaya na samfurin haɓakawa zai shafi ingantaccen ci gaba na PCR.Ta hanyar tsinkaya ko akwai wani tsari na biyu a cikin jerin abubuwan da aka yi niyya a gaba, yi ƙoƙarin kauce wa wannan yanki a cikin ƙirar ƙira.
7. Su kansu da kuma tsakanin masu gyara ya kamata su yi ƙoƙari su guje wa ginshiƙan haɗin gwiwa a jere.
Ba za a iya samun madaidaicin tushe guda 4 a jere tsakanin na farko da na farko ba.Matsakaicin kanta bai kamata ya sami jerin abubuwan da suka dace ba, in ba haka ba za ta ninka kanta don samar da tsarin gashin gashi, wanda zai shafi haɗin haɗin kai da samfurin.
Madaidaitan jeri ba zai iya wanzuwa tsakanin firamare na sama da na ƙasa ba.Ƙarfafawa tsakanin firamare zai samar da dimers na share fage, wanda zai rage ingancin PCR har ma ya shafi daidaitattun ƙididdiga.Idan sifofin farko-dimer da gashin gashi ba za a iya kaucewa ba, ƙimar △G bai kamata ya yi girma ba (ya zama ƙasa da 4.5 kcal/mol).
8. Masu farawa suna haɓaka takamaiman samfurin da aka yi niyya.
Babban makasudin gano qPCR shine fahimtar yawan kwayar halittar da aka yi niyya.Idan haɓakawar da ba takamaiman ta faru ba, ƙididdigewa zai zama kuskure.Sabili da haka, bayan an tsara abubuwan farko, suna buƙatar gwada su ta BLAST, kuma ana kwatanta takamaiman samfuran a cikin bayanan jeri.
Na gaba, muna ɗaukar GAS6 ɗan adam (Ci gaban ƙayyadaddun ƙayyadaddun ƙayyadaddun 6) a matsayin misali don tsara ƙirar qPCR.
01 tambayar gene
Homo GAS6ta hanyar NCBI.A nan, ya kamata mu mai da hankali ga kwatanta sunan jinsi da nau'in jinsin don tabbatar da cewa sun daidaita.
02 Nemo jerin kwayoyin halitta
(1) Idan jerin abubuwan da aka yi niyya shine DNA na genomic, zaɓi na farko, wanda shine jerin DNA na kwayoyin halitta.
(2) Idan jerin manufa shine mRNA, zaɓi na biyu.Bayan shigar, danna "CDS" a cikin tebur da ke ƙasa.Jerin bangon launin ruwan kasa shine jerin coding na kwayoyin halitta.
03 Zane-zane
Shigar da keɓancewar farko-BLAST
Shigar da lambar jerin kwayoyin halitta ko jerin a cikin tsarin Fasta a hagu na sama, kuma cika sigogi masu dacewa.

Danna "Samu masu ƙira" kuma NCBI za ta tashi don gaya muku cewa irin wannan zaɓin zaɓin za a ƙara shi zuwa wasu bambance-bambancen daban-daban.Za mu iya duba bambance-bambancen splicing daban-daban kuma mu ƙaddamar da su don samun nau'i-nau'i masu dacewa (kamar yadda aka nuna a cikin hoton da ke ƙasa).Wannan tsari na iya ɗaukar dubunnan daƙiƙai don gudana.
Yanayin zafi na waɗannan nau'i-nau'i na farko yana kusan 60 ° C.Dangane da dalilin gwajin, zabi primers tare da tsayin daka, kyakkyawan tsari da karancin hadin kai na firayim minista, da kuma kudin nasara yayi kyau sosai!
04 Tabbatar da ƙayyadaddun mahimmanci
A haƙiƙa, ban da ƙirƙira abubuwan ƙira, Primer-Blast kuma na iya kimanta abubuwan da muka tsara kanmu.Koma zuwa shafin zane na firamare, shigar da firamare na sama da na ƙasa da muka tsara, kuma sauran sigogi ba za a daidaita su ba.Bayan ƙaddamarwa, za ku iya ganin ko nau'in nau'i-nau'i ma sun wanzu akan wasu kwayoyin halitta.Idan duk an nuna su akan kwayar halittar da muke son fadadawa , yana nuna cewa ƙayyadaddun wannan nau'i na na'urorin farko yana da kyau!(Misali, wannan shine kawai sakamakon tambayar farko!)

05 Mafi kyawun hukunci
Wani nau'i na firamare shine "cikakkiyar" firamare wanda ya haɗu da "ƙarfin haɓakawa har zuwa ma'auni", "halayen samfuran haɓaka", da "sakamakon gwaji masu dogaro"?
Ingantaccen haɓakawa

lankwasa narkewa
Ƙwararrun haɓakawa na masu haɓakawa ya kai 90% -110%, wanda ke nufin cewa haɓakar haɓakawa yana da kyau, kuma ƙwayar narkewa tana da tsayi guda ɗaya kuma yawanci Tm> 80 ° C, wanda ke nufin cewa ƙayyadaddun haɓaka yana da kyau.
 
Samfura masu dangantaka:
Real Time PCR Easy-SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman